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WB成功与否的关键

WB成功与否的关键

                                                                    WB成功与否的关键
严重影响WB实验结果的关键点有:蛋白提取,制备凝胶,电转膜,封闭,一抗孵育,二抗孵育,化学发光,曝光时间。基本上任何一步实验做不好都会影响它的结果,所以很多人都说WB难做就是这个原因。


首先说说蛋白提取,找一个好的细胞裂解液是做好WB最最重要的一步,提不好蛋白一切都是白搭。网上有许多的配方,大家可以慢慢去试找到一个合适自己的。

然后是凝胶的配置,这个主要是要注意目的蛋白分子量的大小要和你所配置的分离胶浓度相对应,大分子量的蛋白就要配置低浓度的胶,小分子的蛋白就要配置高浓度的胶。最后把pH值调准,不使用凝胶边缘的孔道。PS:制胶板肯定是要洗干净的。

电转膜的时候,注意小分子蛋白和大分子蛋白的转膜是有区别的(湿转):
大分子与小分子蛋白的转膜
    大分子蛋白质(>100KDa)
1.大分子蛋白跑的十分的慢,所以要确定分离胶的浓度不要大于8%,同时转膜的时间还要适当的延长;
2.大分子蛋白质很容易在凝胶里沉淀,阻碍转移。在转膜缓冲液中加入SDS可以阻止大分子蛋白质沉淀,但甲醇会把SDS从蛋白质中脱离下来,所以降低转膜缓冲液中甲醇的含量有利于大分子蛋白质的转膜;
小分子蛋白质(<100KDa)
1.SDS会阻碍所有的蛋白质结合到膜上,而小分子蛋白质所受到的影响会比大分子蛋白质大,所以如果目的蛋白的分子量比较小的话,要考虑把SDS从转膜缓冲液中移除;
2.保持转膜缓冲液中甲醇的浓度在20%左右。 
除了这个还要注意转膜的电流和时间,我是转恒流300mA,小于100KDa的转1.5小时以内就够了。当然膜,胶与滤纸之间要没有气泡啦!


封闭,要注意时间稍微长一点会更好,多于2个小时是个不错的建议,室温下孵育就可以了。要注意的是做磷酸化目的蛋白的时候不能用脱脂牛奶封闭,要用BSA。


一抗孵育和二抗孵育,强烈建议使用好的抗体(特别是刚做WB实验的同仁们)。抗体出现问题影响结果是比较少出现的。一抗孵育一般建议使用1:1000的抗体稀释比例,室温孵育1.5小时。二抗孵育建议使用1:6000的抗体稀释比例,室温孵育1.5小时。(补充一点,我配置的胶的厚度是0.75毫米的薄胶,上样量是每个孔道20微克总蛋白)


最后是化学发光,这个主要注意就是选一个比较好试剂就行了。

曝光时间是各人选择合适的时间就可以了,主要是要注意所得的条带不要显得太粗就可以了。

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